Prueba de Oxidasa

Fundamento

Determina la presencia del citocromo C. La oxidación se detecta como color azul. Deberá aparecer un color azul oscuro antes de los 10 segundos transcurridos desde que se deposita la muestra.

Materiales

• Tiras reactivas para la oxidasa.
• Asa de siembra desechable.
• Muestras 
• Mechero Bunsen.

Procedimiento

• Cogemos  muestra de uno de los tubos, con el asa de siembra.
• Con cuidado, ponemos una cantidad de muestra, en el sitio de la tira específica para la muestra.
• Esperamos unos segundos.
• En caso de que sea positiva, deberá aparecer un colo azul oscuro donde se ha depositado la muestra, de no ser así, tendremos un resultado negativo.
• En caso de que, pasados los 10 segundos, la tira comienza a ponerse azul, no será un signo de que la muestra sea positiva, la tira reaccionar con el oxígeno presente en el ambiente.

Resultados

• Muestra nº8: Negativa
• Muestra nº13: Negativa.
• Muestra nº12: Negativa.
• Muestra nº5: Negativa.
• Muestra nº21: Negativa.

Prueba de la Glucosa O/F

Fundamento

Indica del tipo de metabolismo energético: respiratorio (O) o fermentador (F). 

Se suele utilizar glucosa como sustrato. Se detecta la acumulación de ácidos con un indicador ácido-base. La bacteria se inocula por picadura  y se incuba en condiciones de aerobiosis (sin parafina)  y de anaerobiosis (con parafina, tubo cerrado). 

Las bacterias que respiran aerobiamente crecen en la superficie del medio del tubo abierto. Transforman la glucosa en CO2, la superficie del medio se verá ligeramente amarilla (por la formación de ácido carbónico originado al reaccionar el CO2 con el agua del medio). 

En un tubo cerrado el cultivo se mantiene azul-verdoso. Las bacterias fermentadoras producen ácidos a partir de la glucosa. Viran el cultivo del tubo cerrado a amarillo; en el tubo abierto se inicia el viraje en el fondo, pero transcurridas 24 horas los ácidos pueden difundir por todo el medio cambiando de color a amarillo.

Materiales

• Asa de siembra
• Dos tubos con medio Hugh – Leifson
• Mechero Bunsen.

Procedimiento

• Flameamos el asa y el cuello del tubo, recogemos inoculo de los tubos inclinados.
• Flameamos el tubo y lo cerramos con el tapón.
• Cogemos el tubo con Hugh – Leifson, tapado con parafina.
• Introducimos el asa en el medio. Lo removemos levemente, para dejar más cantidad de muestra y la sacamos el asa.

• Flameamos el asa y repetimos el mismo proceso con el tubo con Hugh – Leifson sin parafina.

Resultados

Muestra nº13: En el tubo con parafina, hay producción de gases y es de color amarillo-anaranjado homogéneo.

 El tubo que no lleva parafina, es amarillo homogéneo. Hay metabolismo aerobio facultativo.

Muestras nº5, 21 y 8: No hay ni fermentación ni oxidación, por lo que tiene un color verde homogéneo.

Siembra en Agar Sangre

Fundamento

El agar sangre es un medio de aislamiento especialmente diseñado para facilitar el crecimiento de microorganismos exigentes, bacterias Gram+ y todas las especies encontradas en mustras de origen clínico. Contiene una mezcla de peptonas particularmente adaptada al cultivo de microorganismos exigentes y la presencia de sangre permite la determinación de la hemólisis.

1. α-Hemólisis: Hemólisis parcial; la zona de crecimiento aparece rodeada de un halo verdoso.
2. β-Hemólisis: Hemólisis total, con halo transparente alrededor.
3. γ-Hemólisis: Sin hemólisis, ya que el microorganismo es incapaz de realizarla y, por tanto, no existe halo alrededor de la muestra

Materiales

• Muestras 
• Asa de siembra
• Mechero Bunsen
• Mechero
• Gradilla
• Placas con agar sangre

Procedimiento

1. Rotulamos placas con los numeros 5/8/13
2. Encendemos el mechero Bunsen
3.  Con el asa de siembra, cogemos la muestra de los tubos con nuestras muestras
4. Sembramos por estria por agotamiento en el agar sangre, una de las placas dividida en 3 y otras dos placas partidas por la mitad
1. Introducimos las placas en estufa a 37º durante 24h

Resultados


Clara  β-Hemólisis, ya que puede distinguirse un halo alrededor de la siembra, lo que significa, que el microorganismo ha consumido los nutrientes de su alrededor. 5, 8 y 12 (hemolisis total, devora agar)


Nº13 Alfa hemolisis (parcial

Siembra en Medio MacConkey y en Medio Levine

Fundamento
Medio Levine: medio de cultivo usado para el aislamiento y diferenciación de E.coli, tiene un aspecto purpúreo, aunque naranja tras su esterilización, es semisólido, y está destinado al cultivo en placa.

Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y permite la diferenciación de bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa, dando lugar a colonias incoloras, las no fermentadoras, y colonias de color azulado-negro con cierto brillo metálico, las fermentadoras.

Medio MacConkey El agar MacConkey es un medio de cultivo selectivo y diferencial para bacterias diseñado para aislar selectivamente bacilos Gram negativos y entéricos (encontrados normalmente en el tracto intestinal) y diferenciarlos en base a la fermentación de la lactosa. El cristal violeta y las sales biliares inhiben el crecimiento de organismos grampositivos, lo que permite la selección y el aislamiento de bacterias gramnegativas. Las bacterias entéricas que tienen la habilidad de fermentar lactosa pueden ser detectadas utilizando el carbohidrato lactosa y el indicador de pH rojo neutro

Material

• Mechero Bunsen.
• Mechero.
• Tubos inclinados con la muestras (sembrados en agar).
• Placa con el medio MacConkey.
• Gradilla.
• Asa de Siembra

Procedimiento

1. Recogemos inoculos 5/8/21
2. Encendemos el mechero bunsen para crear un ambiente de esterilidad
3. Sembramos en medio MacConkey, abrimos la placa y sembramos por estria multiple
4. Metemos el medio en la estufa y comprobamos el crecimiento

Resultados

Crecimiento puntiforme

Siembra medio Levine

Materiales

• Asa de siembra.
• Mechero Bunsen.
• Mechero.
• Gradilla.
• Tubos con la muestra.
• Placas Petri con el medio Levine.

Procedimiento

Es el mismo procedimiento que la siembra anterior.

Resultados

 Colonias negras fermentadoras de lactosa, redondeadas, de forma puntiforme. Color verde brillante

Siembra en Medio KIA

Fundamento
Medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El rojo de fenol es el indicador de pH.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro. Permite un diagnóstico rápido orientativo del tipo de enterobacteria aislado. Las enterobacterias mas patógenas no suelen fermentar (producir ácidos de) la lactosa. Se detecta la producción de ácidos (acompañada o no del desprendimiento de gases) de glucosa o lactosa y producción de SH2.

Materiales

• Asa de siembra.
• Mechero Bunsen.
• Mechero.
• Muestras a sembrar 5,8,12,13 y 21
• Tubos con medio KIA.

Procedimiento

1. Con un asa de siembra flameada, recogemos el inoculo, 
2. La forma de inocular en el medio KIA es por picadura y luego realizamos una estria simple al sacar el asa de siembra
3. Dejamos el medio en la estufa durante 24h
4. Tambien dejamos un medio KIA sin sembrar como control negativo

Resultados

Para la lectura de resultados:

• Producción de ácidos de la glucosa. En la superficie del medio las enterobacterias respiran consumiendo la glucosa. Cuando la agotan (solo tiene 0.1%) consumen los péptidos y se alcaliniza el medio (superficie rosa). En el fondo las enterobacterias fermentan la glucosa produciendo ácidos (fondo amarillo).
• Producción de ácidos de la lactosa (y de la glucosa). En la superficie del medio las enterobacterias respiran utilizando la glucosa y luego la lactosa. En el fondo producen una elevada cantidad de ácidos y difunden hasta la superficie (todo el medio amarillo).
• Producción de SH2  (color negro). la bacteria ha realizado una respiración anaerobia utilizando el tiosulfato como aceptor de electrones; el tiosulfato se convierte en SH2que con el Fe3+ origina S3Fe2.

Control - 

Muestras:

• 5=Fermenta glucosa (rojo-rosado arriba), por lo que hay un pH alcalino. El fondo del tubo es amarillo, pH ácido.
• 13=Fermenta glucosa (rosa-rojizo arriba). Produce H2S que provoca que el medio se vuelva negro, al realizar una respiración anaerobia, utilizando el tisulfato como acepto de electrones. Produce gas, lo que se puede comprobar por las roturas que hay presentes en el medio. Fondo amarillo, pH ácido.
• 12=Fermenta glucosa (rosa-rojizo arriba). Produce H2S que provoca que el medio se vuelva negro, al realizar una respiración anaerobia, utilizando el tisulfato como acepto de electrones. Produce gas, lo que se puede comprobar por las roturas que hay presentes en el medio. Fondo amarillo, pH ácido.
• 21=Fermentación de glucosa (pico rojo-rosado) pH alcalino. La parte inferior es amarilla, por lo que tiene pH ácido.
• 8=Fermenta glucosa y lactosa, por lo que toda la muestra tiene un pH ácido. Produce gases que rompen el medio.

Elaboracion de Caldo nutritivo con glicerol "Crioconservacion"

Fundamento
Utilizaremos este medio para conservar microorganismo durante un largo periodo de tiempo en el congelador, pues el crecimiento de los microorganismos a las temperaturas bajo cero, ralentiza o inhibe su crecimiento

Materiales

• Glicerol

Glicerol al 20% 200ml

8g/l Caldo

d= m/v ; 1,257= 40/V

V= 31.82

200-31.82 = 168`18 H2O

• 
• Campana de extracción
• Gradilla
• Vidrio de reloj
• Probeta
• Micropipetas
• Puntas de pipetas esteriles
• Autoclave
• Agua Destilada

Procedimiento

• Pesamos 1.6g de caldo nutritivo 
• 
• 31.82ml de glicerol en una probeta y 168.18 ml de H2O para llegar a los 200 ml, disolvemos
• Echamos el medio en un frasco Iso, homogeneizamos la mezcla y lo metemos al autoclave a esterilizar
• Cuando el programa haya terminado lo dejamos enfriar a temperatura ambiente
• Una vez enfriados, echamos el medio crioconservador en tubos Eppendorf con puntas esteriles 1ml, en campana extractora.

Y por ultimo guardamos los medios en el congelador

Recogida de Muestras y Tincion de Gram