Recogida de Muestras y Tincion de Gram

Practica: Prueba de la catalasa

Fundamento
La catalasa es un enzima que se encuentra en la mayoria de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos que contienen citocromo. El peroxido de hidrogeno es un producto final de la degradacion aerobica oxidativa de los hidratos de carbono. La catalasa actua sobre el peroxido de hidrogeno descomponiendolo en agua y oxigeno (Gas). Sirven para diferenciar Streptococcus - de Staphylococcus +

Material

• Portaobjetos
• micropipeta
• Asa de Siembra
• Mechero
• Tubo de esayo

Reactivos

• Agua oxigenada
• Muestras

Procedimiento

1. Tomamos una muestra con el asa de siembra una colonia del cultivo
2. Colocamos la colonia con el asa de siembra sobre un porta
3. Se le echa una gota de peroxido de hidrogeno, si burbujea significara que es Catalasa + si no sera -

Resultados

Catalasa	Porta	Tubo
13	+	+
12	+	+
21	+* Con poca actividad	+* Pero con poca actividad
8	+	+
5	+	+

Practica Reconocimiento Macroscopico 5/21/8

Siembra en Agar nutritivo de las preparaciones 5, 8, 21 en placa petri.

Materiales

• Asa de Siembra
• Placa petri con agar nutritivo
• Muestras problema en agar tubo inclinado
• Mechero bunsen

Procedimiento

1. En un tubo inclinado con agar donde guardamos los microorganismos para su recogida y estudio. Recogemos el inoculo del tubo inclinado las muestras con el asa esterilizada,
2. Realizamos una siembra de estria multiple por agotamiento.

Muestras Problema:

5 = Tamaño Grande

Forma Convexa e irregular

Superficie Lisa

Consistencia mucosa

Borde Ondulado

Sin transparencia

8= Tamaño puntiforme

Forma plana y concava

Superficie lisa

Consistencia mucosa

Borde Lisa

Sin transparencia

21= Tamaño muy grande velo invadiendo toda la superficie

Superficie papilada

Consistencia dura y seca

Borde Filamentoso

con transparencia

Practica Recuento de microrganismos en placa

Recuento directo de microorganismos

Fundamento:

Determina el número de células microbianas visibles que desarrollan colonias en el medio de cultivo usado. Cada colonia se forma a partir de una sola célula o de pequeños agregados, por lo que se habla de UFC (unidades formadoras de colonias).

Se realizan diluciones seriadas con un factor común 1·10 o 1·100 de la muestra y se cultiva 1 ml de cada una de ellas. La siembra puede ser en césped o en masa (técnica de Barry), aunque en masa hay muchos microorganismos que no aguatan la temperatura.

Se incuba 24h y se hace el recuento de aquellas placas que tengan entre 30 y 300 colonias.

Materiales

• Asa de Siembra
• Tubo de ensayo
• Mechero Bunsen
• Medio de cultivo en placa petri solido esteril, medio de cultivo liquido en tubo
• Asa de Digralsky
• Gradilla
• Micropipeta
• Vaso de precipitado con Alcohol

Procedimiento

Siembra previa al vertido del medio en la placa. Para ello:

1. En un medio de cultivo fundido (unos 15ml de medio) en tubo,se adiciona la cantidad del inoculo y se homogeiniza la muestra agitandolo. 1 ml de caldo nutritivo y 9 ml de Suero, dilucion 1/10 1/100 1/1000
2.  Una vez, constituida la muestra, se vierte en una placa petri esteril con una micropipeta 1ml del medio liquido con el inoculo que se encuentra en el tubo. 
3. Se homogeiniza el medio con el inoculo con un asa de Digrasky en alcohol. Previamente esterilizada en el mechero bunsen
4.  Una vez bien extendida la muestra, la dejamos secar y le damos la vuelta.
5. Para ver las colonias en medio sólido, cogeremos un inóculo de cada una de las muestras (con las condiciones de esterilidad y seguridad ya dichas) y las sembraremos en placa mediante la siembra por agotamiento en estría múltiple.
6.  Estas también las dejaremos en reposo durante 24 horas, para poder hacer posible el recuento de las colonias en placa.

Resultados

Lo ideal hubiera sido un recuento de placas en las que hubieran entre 30-300 colonias, no ha sido posible ya que no han crecido las suficientes como para hacer el recuento

-Se tendrian que haber contado la mitad de una placa petri y haberlas multiplicado x2

Practica de averiguacion de estudios de microorganismos (Tincion de Gram y morfologia)

Durante todo el trimestre realizamos el estudio de microorganismos adjudicados a cada grupo
Nº= 8, 21, 12, 13, 5

Tincion y observacion al microoscopio

Materiales

• Asa de siembra
• Mechero bunsen
• Pipeta Pasteur
• Cristalizador
• Barras paralelas
• Frasco lavador
• Aceite de inmersion
• Colorantes (Cristal violeta, lugol, Alcohol 96% y safranina)
• Portaobjetos
• Microoscopio

Procedimiento

1º Frotis en porta de todos los microorganismos
Con el mechero bunsen en funcionamiento colocamos una gota de suero en el porta y colocamos la muestra sobre la gota de suero realizando el frotis, despues de recoger el inoculo con el asa de siembra. Con ayuda del mechero damos pasadas para la fijacion de la muestra en el porta
2º Tincion de Gram
Realizamos la tincion de gram. Puede verse en practica nº5
3º Visualizacion al microscopio

Tincion de Nª 8

Tincion Nº 12

Tincion de Nº 5

Tincion de Nº13

Tincion de Nº21

Resultados:
8= Cocos y Staphilococos Gram -
12= Bacilo Gram -
5= Cocos y estreptococos Gram -
13=Cocos y Diplococos Gram -
21= Cocos y Diplococos Gram -

Practica Escala McFarland

Escala McFarland

Fundamento
Los estándares de turbidez de McFarland se usan como referencia en suspensiones bacteriológicas para saber que el número de bacterias por mililitro, o más bien en UFC según una escala que va de 0.5 a 10. Estos estándares son creados al mezclar soluciones de cloruro de bario al 1% con ácido sulfúrico al 1% en volúmenes específicos, para asegurar la densidad correcta se puede controlar usando espectofotometros.

Los estándares pueden ser visualmente comparados con suspensiones de bacterias en salina estéril o en caldos. Si la suspensión es demasiado turbia, puede añadirse diluyente, y si no es lo suficiente turbia, se puede agregar más bacterias. La ventaja es que no es necesario incubar ni usar equipo especial para estimar el número de bacterias

Materiales

• Tubos de ensayo
• Vaso de precipitados
• Espectrofotometro
• Gradilla
• Micropipeta
• Pipeta
• Vidrio de reloj
• Cabina de seguridad
• Agua destilada
• Probeta de 500 y 100 ml
• Balanza
• H2SO4 (0.18M)
• BaCl2 (0.048M) ml

Procedimiento

1. Preparamos 500 ml de Acido sulfurico 98% a 0.18M

d= 1000/540 = 1.85 

M= nº moles/ V(L) = 0.18

0.18= m x 98 / 0.5 ; m= 8.83g

1.85= 9.02/x ; x=4.87ml

2. Preparacion de 100ml de cloruro de bario 0,048M

PM BaCl2 = 208,8

PM BaCl2  x 2H2O= 208,8

0.048 = m x 205,3 /0.1; m = 0`999g

208´3---------0`999g

244`2--------- x                  x=1,47g

PROCEDIMIENTO

1. Empezamos preparando las diluciones madre
2. Primero se pipeteara el BaCl2, despues el acido sulfurico y despues se agitara
3. Preparamos en la cabina de bioseguridad, despues colocamos 10ml de cada matraz en los tubos de ensayo los cuales los utilizaremos para hacer estos recuentos de forma indirecta

• Nº10: 10 ml BaCl2 + 90 ml H2SO4
• Nº9: 9 ml BaCl2 + 91 ml H2SO4
• Nº8: 8 ml BaCl2 + 92 ml H2SO4
• Nº7: 7 ml BaCl2 + 93 ml H2SO4
• Nº6: 6 ml BaCl2 + 94 ml H2SO4
• Nº5: 5 ml BaCl2 + 95 ml H2SO4
• Nº4: 4 ml BaCl2 + 96 ml H2SO4
• Nº3: 3 ml BaCl2 + 97 ml H2SO4
• Nº2: 2 ml BaCl2 + 98 ml H2SO4
• Nº1: 1 ml BaCl2 + 99 ml H2SO4
• Nº0.5: 0.5 ml BaCl2 + 99`5 ml H2SO4

Colocamos la escala de MacFarland en tubos para poder medir Visualmente

Estandar	H2SO4 (0.18M) ml	BaCl2 (0.048M) ml	Nº Bacterias/ml
0.5	99.5	0.5	1.5x108
1	99	1	3 x108
2	98	2	6 x108
3	97	3	9 x108
4	96	4	1.2 x109
5	95	5	1.5 x109
6	94	6	1.8 x109
7	93	7	2.1 x109
8	92	8	2.4 x109
9	91	9	2.7 x109
10	90	10	3.1 x109

Practica 6 Tincion Ziehl-Neelsen

TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN

Algunas bacterias denominadas ácido alcohol resistentes presentan una pared celular muy rica en ácidos grasos de cadena larga, denominados ácidos micólicos, que la hacen resistente a la decoloración con alcohol ácido, una vez que hayan sido teñidos con colorantes básicos.

Objetivo:
Detectar las bacterias ácido alcohol resistentes mediante la tinción de Ziehl Nielsen

MATERIALES:

• Equipo de tinción
• Mechero Bunsen
• Microscopio
• Portaobjetos
• Asa de siembra de platino
• Torunda
• Algodon y espadadrapo

REACTIVOS

• Fucsina fenicada 
• Alcohol- ácido
• Azul de metileno
• Agua destilada

PROCEDIMIENTO:

1. Extensión, desecación y fijación
2. Echar fucsina fenicada durante 1 minuto en frio y 5 minutos a emisión de vapores.
   
3. Decoloración con alcohol-ácido unos 30 segundos, hasta que se elimine el rojo.
4. Lavar con agua destilada.
5. Azul de metileno durante 1-2 minutos.
6. Lavar, secar y observar.
   
   
   
   
   
   
   
   

RESULTADOS:
Morfología de Micobacterium