Funcionamiento de autoclave

AUTOCLAVE

El autoclave es un equipo de laboratorio que se utiliza para esterilizar. Por esterilizar se entiende la destrucción o eliminación de toda forma de vida microbiana (incluyendo esporas) presente en objetos inanimados mediante procedimientos físicos, químicos o gaseosos.

El autoclave es un equipo diseñado con el fin de eliminar de forma confiable, los microorganismos que de otra manera estarían presentes en objetos que se utilizan en actividades de diagnóstico, tratamiento o investigación en instituciones de salud (hospitales, laboratorios); también es un equipo de amplio uso en las industrias procesadoras de alimentos y en la industria farmacéutica.

Úsos

1. Preparar el equipo a ser usado en cultivos bacteriológicos (tubo de ensayo, pipeta, platos Petri, etc..), a fin de evitar que se encuentren contaminados.
2. Preparar elementos utilizados en la toma de muestras (todos deben estar en condiciones estéril: agujas, tubos, recipientes).
3. Esterilizar material contaminado.

Los autoclaves o esterilizadores se encuentran disponibles en muchos tamaños, los mas pequeños son los de sobremesa y los mas grandes son equipos complejos que requieren gran cantidad de preinstalaciones para su operación.

Funcionamiento

Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presión interna de 103 kPa por encima de la presión atmosférica, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 120 grados Celsius. Un tiempo típico de esterilización a esta temperatura y presión es de 15-20 minutos. Las autoclaves más modernas permiten realizar procesos a mayores temperaturas y presiones.

1. Llenar el autoclave con agua destilada
2. Introducir el material a esterilizar
3. Revisar las Valvulas -(Agua cerrada / Aire abierto)
4. Cuando alcance los 80ºC

Practica 4. Preparacion de medios de Cultivo liquido y solido en tubo y Solido en placa

 Preparación de Medios de Cultivo

Fundamento

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales  y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.

Los medios de cultivo son el soporte nutricional para que las bacterias cumplan su ciclo vital, se reproduzcan y aumente su población.

         - Medios líquidos: Se les llaman caldos. Se presentan en tubos de ensayo y en el caso de crecimiento bacteriano se puede apreciar de las siguientes maneras:

         - Medios sólidos: Están formados por un soporte gelatinoso, generalmente agar, cuando lo calentamos se licua y si los dejamos a temperatura ambiente, se solidifica. Una vez preparado el medio de cultivo se deposita en placas de petri. Dependiendo del medio de cultivo podemos enriquecer el agar con líquidos biológicos. Con la ayuda de una torunda o placa de petri podemos sembrar en los medios de cultivo ya solidificado.

Preparacion de medio de cultivo liquido en tubo

Materiales

-Frasco ISO

-Mechero Bunsen

-Gradilla

-Tubos de ensayo

-Microondas

-Guantes Termicos

-Balanza Analítica

Reactivos

       Agar nutritivo (Para Caldo de Cultivo)

       Agua destilada

       

Calculos

Lo mas sencillo para calcular la medida necesaria

de Agar nutritivo que debemos usar es realizar una

regla de 3

Procedimiento

1º Preparamos el material en la zona de trabajo.Medimos el volumen de agua que necesitamos para realizar el medio de cultivo liquido, 350ml para 35 tubos de 5 ml cada uno.
Para ello utilizaremos una probeta, y vertiremos la cantidad de
agua destilada necesaria. Después pesaremos la cantidad de caldo nutritivo 


                     en la balanza, 8 gramos (siempre procuraremos 
                      echar un poco mas de la cantidad necesaria por
                      si tenemos perdidas.

2º Colocaremos en el frasco Iso una base de agua de esos 350ml necesarios, que sirva de colchon para que a la hora de echar el medio solido, es recomendable que el agua ya este caliente paraque se diluya mejor y agitar bien para que no queden grumos. Llevar al microondas controlando que no llega a ebullición completamente.

Autoclavamos para esterilizar:

3º  Por ultimo con una pipeta, extraer 10ml
de caldo de cultivo y vertirlo en tubos de ensayo, y le ponemos una gasa y tapón, 
para que no entren partículas que puedan interferir.



















Preparación de medio de cultivo solido en Placa Petri

La preparación de un medio solido en placa tiene el mismo proceso que el medio de cultivo liquido. Se necesita:

Material

-Frasco ISO

-Mechero Bunsen

-Gradilla

-Placa petri

-Microondas

-Guantes Termicos

-Balanza Analitica

Reactivos
-Agua destilada
-Agar Nutritivo

Calculos

Pesamos la cantidad de agar que necesitamos para prepararlo según su relación indicada en el bote

Lo mas sencillo para calcular la medida necesaria

de Agar nutritivo que debemos usar es realizar una

regla de 3

En el Bote del producto aparecen los gramos necesarios

para 1 Litro, que son 23g.

350ml x 23g / 1000ml = 8.05g

10ml en cada tubo

Procedimiento

- El procedimiento a seguir es muy similar al anterior, pesamos la cantidad necesaria de Agar nutritivo, medimos la cantidad de agua necesaria en una probeta, y lo mezclamos en un frasco ISO donde se calentara en el microondas hasta casi su ebullición.

1- Preparamos el material que necesitamos en un orden lógico donde podamos manejarnos correctamente.



2- Con mucho cuidado comenzamos a rellenar las placas con el mechero bunsen encendido y lentamente sin hablar, para no contaminar la placa.



Necesitaremos alrededor de 15 ml por placa, tenemos que rellenar casi la mitad de la placa con el agar nutritivo.

Esperaremos a que el agar solidifique pasado un tiempo.

Cuando todas las placas estén solidas llevaremos las placas al autoclave para su esterilización.

Cuando la esterilización termine en el autoclave, rotulamos las placas con la identificación necesaria para evitar errores y equivocaciones.







Resultado:



Placas Petri listas para su cultivo


















Preparación de medio de cultivo solido en tubo inclinado

Material

-Frasco ISO

-Mechero Bunsen

-Gradilla

-Tubo de ensayo

-Microondas

-Guantes Termicos

-Balanza Analitica

Reactivos
-Agua destilada
-Agar Nutritivo

Calculos
Pesamos la cantidad de agar que necesitamos para prepararlo según su relación indicada en el bote

Lo mas sencillo para calcular la medida necesaria

de Agar nutritivo que debemos usar es realizar una

regla de 3

En el Bote del producto aparecen los gramos necesarios

para 1 Litro, que son 23g.

350ml x 23g / 1000ml = 8.05g

5 ml en cada tubo

Procedimiento

- El procedimiento a seguir es muy similar al anterior, pesamos la cantidad necesaria de Agar nutritivo, medimos la cantidad de agua necesaria en una probeta, y lo mezclamos en un frasco ISO donde se calentara en el microondas hasta casi su ebullición.

1- Preparamos el material que necesitamos en un orden lógico donde podamos manejarnos correctamente.

2- Comenzamos a vertir el agar nutritivo en los tubos de ensayo con cuidado y los volcamos hasta que solidifiquen y se queden asi:


Rotulamos y ya están listos para sembrar.

Practica 3º: Tinción Vital. Preparacion de Tinciones y extensión de Actimel

Tintes: Safranina/ Fuscina/ Azul de metileno

Fundamento: El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares.

Materiales

• Matraz Aforado 100ml
• Mechero Bunsen
• Asa de siembra
• Portaobjetos y Cubre
• Tubo de ensayo
• Balanza analitica
• Vaso de Precipitados

Reactivos

• Agua Destilada
• Tintes: Safranina (Solido), Fuscina Basica, Azul de metileno
• Suero Fisiologico
• Muestra: Actimel

Procedimiento

1º Preparamos los tintes, comenzando por la Fuscina Basica que es un tinte solido, preparamos una tinción 1/100.000, lo que quiere decir que se necesita 0,1g de Fuscina Basica diluido en 100ml de Agua destilada. Pesamos esos 0,1g de Fuscina Basica en la balanza, en un vaso de precipitados mezclamos el tinte con agua destilada hasta que no quedan grumos. Vertimos la mezcla en un matraz aforado de 100ml. (Es aconsejable a la hora de vertir el tinte no enrasar el matraz de una sola vez y utilizar agua destilada para hacer varios lavados del vaso de precipitados para no perder la mayor cantidad de tinte posible).

- Preparamos la solucion de Azul de metileno 1/1000 y 1/500, son tintes liquidos por lo que para su realización necesitaremos 1ml y 0,5ml de este tinte respectivamente, con una micropipeta vertimos el tinte en un matraz de 100ml y enrasamos con agua destilada.

- Preparamos la solucion de Safranina 1/100, tinte liquido, en el que utilizaremos 0,1ml de este tinte medidos con una micropipeta y enrasamos en un matraz con agua destilada.

Para finalizar rotulamos, los matraces y los tapamos con parafina.

2º Rotulamos portaobjetos con las tinciones que vamos a utilizar en cada uno de ellos. Con una pipeta pasteur colocamos una gota de suero fisiologico. Con un asa de siembra recogemos la muestra de actimel y realizamos un frotis en el portaobjetos utilizando la gota de suero fisiologico como base para la muestra.

3º A continuacion con una pipeta pasteur usamos una gota de nuestros tintes sobre nuestras muestras. Con un cubre sobre la parte del frotis y el tinte, comenzamos la observacion.

- Interpretacion de los Resultados: Se han observado